AUTORA: PACHECO, Sidelcina Rugieri.
ORIENTADOR: SILVA, Luciano Kalabric.
TÍTULO DA TESE: Avaliação de mutações de resistência ao tratamento com análogos de nucleo(t)ídeos e de escape vacinal do vírus da hepatite B (VHB) em pacientes com hepatite crônica.150 f.il.
PROGRAMA: Doutorado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz.
DATA DE DEFESA: 15/04/2016

RESUMO

INTRODUÇÃO: A hepatite B (VHB) é uma infecção dinâmica crônica, que apesar de existir programas de imunização e tratamento antiviral disponível, existe o risco de emergência de mutações de resistência aos análogos de núcleos(t)ídeos (AN) que devem ser rastreadas, devido as suas implicações clínicas. O Brasil disponibiliza pelo SUS cinco drogas para o tratamento antiviral: IFN, LAM, ADF, ETV e TDF e um guia de conduta clínica para orientar o tratamento no território nacional, o Protocolo de Diretrizes Terapêuticas para Hepatite B e co-infecções.

OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi avaliar as mutações de resistência aos AN, mutações de escape vacinal e genótipos circulantes em pacientes com hepatite B crônica em dois centros de referência em Hepatites, na Bahia (região Nordeste) e no Acre (região Norte) do Brasil.

MATERIAL E MÉTODOS: Foi utilizada ferramentas de biologia molecular e bioinformática, através de nested PCR e sequenciamento direto das amostras, para rastrear as mutações de resistência, a região alvo foi a transcriptase reversa (RT) do gene P e as mutações de escape vacinal foi a região do gene S do VHB, como também os genótipos e subgenotipos do VHB.

RESULTADOS: Foram incluídos 527 pacientes durante o período de 2011-2015, sendo 320 pacientes do HUPES/BA e 207 do FUNDHACRE/AC. Os pacientes que representam a região Nordeste foram 59,3 % do sexo masculino e uma média de idade de 44,75±12,4 DP, os pacientes da região Norte 42% foram do sexo masculino e a média de idade foi de 40,36±13,9 DP. Todos os pacientes incluídos apresentaram AgHBs persistente por mais de seis meses e 86,1% apresentaram AgHBe negativo. Foram sequenciadas 296 amostras dos pacientes com VHB crônica. Foram encontradas mutações de resistência aos AN na Região Norte 1,2% (2), Região Nordeste 7,4%(8) e no global 3,8%(20). Os padrões de mutações de resistência primária encontrados foram: rtA194T, (3) rtL180M+M204V, rtL180M+M204I, rtS202I, rtM204I, rtA181S, rtA181E e rtA184S. Em relação ao escape vacinal a frequência para a Região Norte foi de 7,1% (11), Região Nordeste 8,4% (9) e no global 7,6% (20). Nos pacientes virgens  de tratamento (n=189), a frequência de mutações de resistência foi de 6%, somente nas amostras da região Nordeste. Não houve diferença estatisticamente significante entre o grupo com ou sem mutação dos pacientes virgens de tratamento. Não foram encontradas mutações de resistência nas amostras da região Norte.  Os genótipos circulantes nas duas regiões foram A, D e F, e a região Nordeste foi encontrada o genótipo C (C2).

CONCLUSÃO: Os resultados demonstram a importância de rastrear e monitorar as mutações de resistência aos AN e de escape vacinal devido à importância epidemiológica e clínica na conduta terapêutica.

Palavras-chave: VHB, Vírus da Hepatite B, Mutações de Resistência, Escape Vacinal, Análogos de Núcleos(T)ídeos

AUTORA: SANTOS, Catiule de Oliveira.
ORIENTADOR: OLIVEIRA, Geraldo Gileno de Sá.
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: Produção e avaliação do receptor solúvel de IL-10 canina recombinante (rcasIL-10R1)
PROGRAMA: Mestrado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz.
DATA DE DEFESA: 17/03/2016

RESUMO

INTRODUÇÃO: A interleucina 10 (IL-10) é uma importante citocina anti-inflamatória e imunossupressora que é produzida por uma variedade de células do sistema imune, incluindo linfócitos T e B, células monocíticas, células Natural Killer, células dendríticas, eosinófilos e neutrófilos. O receptor de IL-10 é composto por duas cadeias polipeptídicas denominadas IL- 10R1 e IL-10R2. A cadeia IL-10R1 exibe alta afinidade por IL-10 e é responsável pela ligação inicial com a citocina. Depois da ligação entre a IL-10 e a cadeia IL-10R1, a cadeia IL-10R2 se junta ao complexo protéico formado e é realizada a sinalização para o citoplasma da célula alvo. Existem evidências de que a IL-10 participa na susceptibilidade de seres humanos e cães a leishmaniose visceral. Além disso, a imunização de animais com antígenos e o bloqueio concomitante da sinalização por IL-10 pode favorecer a indução de respostas imunes celulares (Th1), úteis no combate a infecções por patógenos intracelulares.

OBJETIVO: O objetivo do presente projeto foi produzir o receptor solúvel de IL-10 (domínio extracitoplasmático da cadeia IL-10R1, com atividade antagonista) recombinante (rcasIL-10R1), visando estudos futuros de imunomodulação em cães.

METODOLOGIA: Para isso, foram realizadas as seguintes etapas: 1) obtenção de uma construção de DNA codificante de rcasIL-10R1 em um cromossoma artificial de baculovírus desprovido dos genes da catepsina e chitinase, 2) transfecção de células de insetos, obtenção de partículas virais e titulação viral (P1), 3) amplificação e titulação viral (P2), 4) ensaio de otimização para expressão da proteína recombinante em células High five; 5) produção da proteína recombinante em celulas High five e purificação por cromatografia de afinidade e 6) avaliação da capacidade de rcasIL-10R1 bloquear a sinalização de IL-10, utilizando-se células MC/9.

RESULTADOS: A julgar pelo sequenciamento de DNA do inserto na construção plasmídeal carreadora (pFastBac1-GP64-casIL-10R1) e da amplificação por PCR do segmento de DNA contendo o inserto no cromossoma artificial do baculovírus, a obtenção de baculovírus recombinante codificando casIL-10R1 foi realizada com sucesso. O ensaio de otimização da produção da rcasIL-10R1 realizado com células de inseto da linhagem High Five mostrou as melhores condições para foram multiplicidade de infecção (MOI) 5 e tempo de infecção (TOI) de 72h. A proteína recombinante produzida e purificada mostrou uma banda principal de 42 kDa pela análise por eletroforese em gel de poliacrilamida e o rendimento foi de 2,8 mg por litro de cultura. O ensaio realizado com células MC/9 cultivadas na presença de IL-4 e IL-10 com ou sem rcasIL-10R1 mostrou que a proteína recombinante produzida inibiu parcialmente a proliferação das células, sugerindo o bloqueio da sinalização através de IL-10.

CONCLUSÕES: Portanto, no presente trabalho rcasIL-10R1 com capacidade de bloquear a sinalização por IL-10 foi produzido com sucesso, abrindo a perspectiva de futuros estudos de imunomodulação em cães.

Palavras-chave: Interleucina 10, Receptor solúvel de IL-10 canina, Baculovírus, Células MC/9.

AUTORA: FREITAS, Roberta Souza.
ORIENTADOR: ALMEIDA, Maria da Conceição Chagas de.
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: Fatores associados a cintura hipertrigliceridêmica no Estado Longitudinal de Saúde do Adulto (ELSA-Brasil)
PROGRAMA: Mestrado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz.
DATA DE DEFESA: 18/03/2016

RESUMO

OBJETIVO: Estimar a prevalência de cintura hipertrigliceridêmica (CH) dos participantes do Estudo Longitudinal da Saúde do Adulto (ELSA-Brasil), identificar fatores associados à CH e comparar com outros indicadores de risco cardiovascular e metabólico.

MÉTODOS: Dados da linha de base de uma coorte composta por servidores públicos. O fenótipo CH é definido pela presença simultânea de circunferência da cintura (CC) aumentada e hipertrigliceridemia em jejum. O indicador foi construído segundo pontos de corte da CC definidos pelo National Cholesterol Education Program (NCEP) e International Diabetes Federation (IDF). A associação entre as variáveis independentes e CH foi testada por meio de modelos de regressão logística multivariada. A CH foi comparada também com outros indicadores de risco cardiovascular e metabólico por meio de testes de correlação, índice Kappa, sensibilidade e especificidade.

RESULTADOS: Foram avaliados 12.811 funcionários, 54,2% do sexo feminino, a prevalência da CH-IDF foi de 24,7% e a da CH-NCEP de 13,3%. CH foi associado a consumir álcool de modo excessivo, ser ex-fumante, ter hipertensão, diabetes, HDL baixo, não-HDL alto e PCR aumentado, independente do sexo ou critério de definição. A CH também foi associada a auto percepção negativa do estado de saúde entre homens e mulheres classificadas por meio do critério NCEP; a prática de atividade física no tempo livre entre homens; a união atual ou passada entre mulheres com classificação de CH-IDF; e a cor/raça branca e ter seguro de saúde com CH-NCEP no sexo masculino. A síndrome metabólica apresentou maior correlação com CH entre os participantes de ambos os sexos.

CONCLUSÕES: Em decorrência de suas associações e da correlação com síndrome metabólica, o indicador CH pode ser utilizado como ferramenta de triagem para indivíduos com risco cardiometabólico na prática clínica.

Palavras-chave: Cintura Hipertrigliceridêmica; Doenças Cardiovasculares; Doenças Metabólicas; Fatores de Risco.

AUTORA: OLIVEIRA, Barbara Maria Nascimento de.
ORIENTADOR: OLIVEIRA, Geraldo Gileno de Sá.
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: Produção IL-7 canina no sistema baculovírus-células de inseto.
PROGRAMA: Mestrado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz.
DATA DE DEFESA: 21/03/2016

RESUMO

INTRODUÇÃO: A interleucina 7 (IL-7) é uma citocina pleiotrópica produzida principalmente por células estromais da medula óssea, células epiteliais tímicas e intestinais. IL-7 e que promove o desenvolvimento de linfócitos T e B e diferenciação de células T memória, especialmente CD4+. Por isso, diversos autores têm estudado a capacidade de IL-7 promover a restauração da população de linfócitos em situações de linfopenia e resposta imune de memória. Cães que desenvolvem leishmaniose visceral e recebem tratamento específico apresentam cura clínica. No entanto, após a interrupção do tratamento, a maioria dos animais exibe recaída da doença, mesmo na ausência de reinfecção. É possível que esse fenômeno esteja associado a uma dificuldade de estabelecimento de linfócitos T de memória específicos para Leishmania em cães. Em nosso laboratório, tentativas prévias foram realizadas para produzir a IL-7 canina em Escherichia coli, no entanto, o rendimento da proteína biologicamente ativa foi pequeno.

OBJETIVO: Por isso, resolveu-se avaliar a viabilidade de produzir IL-7 do sistema baculovírus-células de inseto.

MATERIAL E MÉTODOS: No presente trabalho, uma construção de DNA foi concebida contendo uma sequência de nucleotídeos que codificam o peptídeo sinal da proteína GP64 do baculovírus da Autographa californica (AcMNPV), a IL-7 canina (proteína madura) com códons otimizados para a tradução em Trichoplusia ni, um espaçador com 23 aminoácidos e uma cauda de seis histidinas. A construção de DNA elaborada foi sintetizada quimicamente, inserida em um plasmídeo de clonagem (pUC57-GP64caIL-7), subclonada em um plasmídeo carregador (pFastBac1- GP64caIL-7), adequado para o sistema baculovirus-célula de inseto, e transferida para o cromossoma artificial do baculovírus recombinante (bacmídeo).

RESULTADOS: A produção de IL-7 recombinante canina (rcaIL-7) em células de inseto infectadas com baculovírus recombinante foi otimizada. Em seguida, a rcaIL-7 foi produzida em células High-five cultivadas em suspensão utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 5 e tempo de infecção (TOI) de 48 h. A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade em Sepharose-níquel, obtendo-se um rendimento médio de 5,5 mg por litro de cultivo.

CONCLUSÃO: RcaIL-7 purificada, avaliada a 40 ng/mL, mostrou-se capaz de promover a proliferação de células mononucleares de sangue periférico de cães sadios, sem estímulo prévio ou concomitante, indicando que a proteína foi produzida biologicamente ativa. Futuros estudos serão realizados para avaliar a capacidade imunomoduladora da rcaIL-7 em cães e determinar a utilidade dessa citocinas no tratamento de enfermidades caninas, como por exemplo, na leishmaniose visceral canina.

Palavras-chave: Interleucina 7; células mononucleares; cão.