Estudante: Flávio Henrique de Jesus Santos
Orientação: Valéria de Matos Borges
Título da Tese: “Aplicação do sistema CRISPR/CAS9 em Leishmania infantum e Leishmania amazonensis: explorando os glicoconjugados (LPG, PPGS PGS E SAP)”
Programa: Pós-Graduação em Patologia Humana
Data de defesa: 30/10/2023
Horário: 14h00
Local: Sala Virtual do Zoom
ID da reunião: 884 0341 3429
Senha: Defesa

Resumo

INTRODUÇÃO: O LPG é um fator de virulência que juntamente com outras moléculas como os PPGs, PGs e sAP participa em uma variedade de processos durante o estabelecimento da infecção no hospedeiro mamífero. A GDP-manose transferase que é codificada pelo gene lpg2 é umas das enzimas essenciais para síntese dessas moléculas que contêm fosfoglicanos (PGs) em suas estruturas. O sistema CRISPR/Cas9 tem eficaz na obtenção de parasitos deficiente do gênero Leishmania para diversas moléculas chave na interação parasito-célula hospedeira. OBJETIVOS: Este estudo tem como objetivo geral utilizar o sistema CRISPR/Cas9 tendo como alvo o gene lpg2 em L. infantum e L. amazonensis (formas clínicas LCL e DCL), agentes etiológicos das formas clínicas de leishmaniose visceral e tegumentar, respectivamente. MÉTODOS: Em L. infantum a edição do genoma foi realizada com a inserção de códons de parada com posterior seleção utilizando ensaios de aglutinação. Em L. amazonensis nós inserimos um gene marcador de resistência no sítio de clivagem da Cas9. Em ensaios in vitro, neutrófilos humanos ou BMDM foram infectados com L. infantum ou L. amazonensis WT ou Δlpg2. A avaliação in vivo envolveu a inoculação de promastigotas de L. amazonensis WT ou Δlpg2 na orelha de camundongos BALB/c. RESULTADOS: Durante o processo de obtenção de L. infantum Δlpg2 detectamos e caracterizamos que este gene estava duplicado nesta espécie. Os resultados obtidos com o sequenciamento mostraram a ocorrência da edição esperada no genoma em todos os clones das duas espécies. Além disso, o resultado do Western blot mostrou a perda completa da expressão do LPG e de PGs. Constatamos que a deleção do gene lpg2 em
L. infantum diminui a taxa de infecção (83%) em neutrófilos, enquanto que para L. amazonensis os ensaios in vitro não revelaram diferenças nas taxas de infecção e replicação entre os parasitos WT e Δlpg2. In vivo o isolado de DCL Δlpg2 apresentou diferenças mínimas no desenvolvimento da lesão em relação ao WT, enquanto que o isolado de LCL Δlpg2 falhou em induzir qualquer desenvolvimento de lesão. CONCLUSÃO: Os resultados reforçam a importância do LPG e outros PGs como fatores de virulência para a L. infantum. Para L. amazonensis a ausência de PGs não parece ser essencial para os ensaios de virulência in vitro. Em contraste, os PGs parecem desempenhar um papel essencial no desenvolvimento da lesão induzida pelo isolado de LCL. Este trabalho amplia o conhecimento da função de glicoconjugados de espécies de Leishmania do Novo Mundo. Palavras chaves: CRISPR/Cas9, L. infantum, L. amazonensis, Lipofosfoglicano, LPG2