Autoria: Sthefany da Conceição Pires
Orientação: Bruno Solano de Freitas Souza
Título da dissertação:  “Caracterização In Vitro do potencial imunomodulador de vesículas extracelulares derivadas de células-tronco mesenquimais da Geleia De Wharton”.
Programa: Pós-Graduação em Patologia Humana e Experimental
Data de defesa: 31/10/2022
Horário: 09h00
Local: Auditório Aluízio Prata

Resumo

INTRODUÇÃO: As MSCs se tornaram alvos de estudos clínicos e pré-clínicos, pelo seu potencial anti-inflamatório e imunoregulador. Sabe-se que parte dos efeitos das MSCs estão relacionados ao seu secretoma, que inclui fatores solúveis, tais como citocinas, proteínas e a liberação de vesículas extracelulares (EVs). As EVs são pequenos componentes celulares, que tem como composição moléculas bioativas (pequenos RNAs, proteínas, entre outras) que foram herdadas das células de origem e desenvolvem ações imunomoduladoras e tróficas. A análise de parâmetros que envolvem o perfil imunomodulador das EVs derivadas de MSCs (MSC-EV) é imprescindível, para ensaios importantes para o desenvolvimento clínico. OBJETIVO: Caracterizar a atividade imunomoduladora in- vitro das hucMSC-EVs em um ensaio de linfoproliferação. MATERIAL E MÉTODOS: As MSC derivadas da geleia de Wharton humana (hucMSC) foram utilizadas para o isolamento e purificação de hucMSC-EVs. As hucMSC foram caracterizadas de acordo com a ISCT analisando morfologia, imunofenotipagem e ensaios de diferenciação. Por RT-PCR avaliamos a expressão de genes relacionados com a biogênese das EVs (CD81, CD63) e ao potencial imunomodulador (IDO1 e TNFAIP6). As hucMSC-EVs foram isoladas em passagem 5 e caracterizadas seguindo as recomendações da ISEV, por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), análise de nanofluxo e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). As células mononucleares do sangue (PBMC) de doadores saudáveis foram estimulados com beads anti-CD3/ anti-CD28 e incubadas com diferentes concentrações de hucMSC-EVs (10,25 e 50 µg/ml) por 72 horas a 37 °C com 5% de CO2, a análise de linfoproliferação foi feita por ensaio de ATP por luminescência. As células T reguladoras (Treg-CD4+CD25+FoxP3+) foram avaliadas por meio de citometria de fluxo. As citocinas do sobrenadante foram quantificadas por ELISA. RESULTADOS: As hucMSC cultivadas apresentaram morfologia fibroblastóide, expressão > 95% para CD90, CD105, CD44, e CD73, com <0,05% de marcadores hematopoiéticos e capacidade de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condroblastos. A privação de lisado de plaquetas humano foi associada ao pico na expressão gênica de CD81, CD63 e TNFAIP6 após 24h, 48h e 72h. A expressão IDO1 não foi detectada. Observamos que a estabilidade do CM permanece quando armazenado a -20°C por 7 dias. As hucMSC-EVs apresentaram diâmetro médio <200 nm, mostraram morfologia típica em TEM e a análise fenotípica demonstrou marcadores positivos para EVs (Annexin, CD81, CD63) e para origem hucMSC (CD90). O tratamento com hucMSC-EVs inibiu a linfoproliferação in vitro em todas as concentrações testadas. A estimulação de Tregs foi ligeiramente aumentada após o tratamento com 50 µg/ml de MSC-EVs. A produção de TNF-a, IFN-y, e IL-10 foi inibida pela incubação com MSC-EVs, enquanto que a IL-6 não apresentou alterações significativas. CONCLUSÃO: As hucMSCEVs apresentaram efeitos imunoregulatórios, por meio da inibição de linfócitos in-vitro, indução moderada de células Treg, porém testes adicionais precisam ser realizados, para elucidar maiores efeitos na aplicação das hucMSC-EVs em larga escala.

Palavras-chaves: Terapia. Células-tronco. Células-tronco mesenquimais. Vesículas extracelulares.