AUTORIA: Gabriela Louise de Almeida Sampaio
ORIENTAÇÃO: Bruno Solano de Freitas Souza
TÍTULO DA TESE: “Geração de linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas com alteração no gene SCN2A e organoides cerebrais como ferramentas para estudo do autismo”.
PROGRAMA: Pós-Graduação em Patologia Humana (UFBA /FIOCRUZ)
DATA DE DEFESA: 20/05/2019

RESUMO

INTRODUÇÃO: Transtornos do espectro autista (TEAs) compõem um grupo de doenças que afetam a interação social, comunicação e comportamento. Nos últimos anos, inúmeras alterações em diferentes genes vêm sendo associadas com TEA. Dentre estes, variantes patogênicas SCN2A vêm apresentando uma forte associação estatística com TEA. O SCN2A codifica a subunidade alfa do canal de sódio voltagem-dependente Nav1.2, que é altamente expresso em células piramidais durante o desenvolvimento do cérebro. Estes neurônios desempenham um papel crítico na organização cortical, excitabilidade e sinaptogênese. Apesar da associação estatística, não há ainda estudos que comprovem a causalidade e os possíveis mecanismos envolvidos na fisiopatologia. Deste modo, a hipótese deste trabalho é de que mutações com perda de função no SCN2A afetam o desenvolvimento do cérebro desde suas etapas iniciais, podendo levar ao desenvolvimento de TEA, e que este processo pode ser estudado in vitro a partir da utilização de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e organoides cerebrais.

OBJETIVO: Estabelecer uma plataforma que permita a investigação do impacto da mutação do gene SCN2A sobre as fases iniciais do neurodesenvolvimento.

MÉTODOS: Células-tronco mesenquimais obtidas de uma paciente portadora de TEA e variante patogênica em heterozigose do gene SCN2A foram reprogramadas utilizando vetores não integrativos para obtenção de uma linhagem de iPSCs (iM5). Esta linhagem foi caracterizada quanto à expressão de marcadores de pluripotência, utilizada em ensaio de formação de corpos embrioides e por análise de cariótipo. Outra linhagem de iPSC, previamente obtida a partir de doador saudável (EB4), foi submetida à edição gênica utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9 para geração de uma linhagem knockout para SCN2A. As iPSCs foram induzidas à formação de organoides cerebrais in vitro, que foram avaliados periodicamente quanto à morfologia e expressão de marcadores relacionados ao desenvolvimento cortical. A expressão do SCN2A foi avaliada nos organoides por PCR e imunofluorescência.

RESULTADOS: As linhagens de iPSCs obtidas apresentaram morfologia característica, expressão dos marcadores de pluripotência, cariótipo normal e se diferenciaram em células dos três folhetos embrionários in vitro. A edição do gene SCN2A realizada na linhagem EB4 deu origem à linhagem knockout EB4CRISPR. O protocolo utilizado para formação de organoides cerebrais foi aplicado nas linhagens EB4, EB4CRISPR e EA1, esta última referente à iPSCs de um outro doador saudável. A expressão de SCN2A foi observada nos neurônios presentes no organoide. Foi observada a presença de neurorosetas na 1a semana e, a partir da 3a semana, a presença de células progenitoras Sox2+ mais concentradas nas regiões internas do organoide, com neurônios βIII tubulina+ localizados na região mais externa. Já a linhagem EB4CRISPR formou organoides maiores, com menor expressão de marcadores de diferenciação cortical e desorganização.

CONCLUSÃO: Neste trabalho geramos duas linhagens de iPSCs com mutações no gene SCN2A e estabelecemos uma plataforma para geração de organoides que podem utilizados como ferramentas para estudo de doenças do neurodesenvolvimento, como TEAs. Alterações na formação das estruturas do organoide foram identificadas nas células knockout para SCN2A, sugerindo um papel importante deste gene nas etapas iniciais da formação do cérebro.

Palavras-Chave: Autismo; SCN2A; iPSC; Organoides cerebrais; CRISPR